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腾博游戏在线凝胶电泳

来源:皓泉环保 发布日期:17-03-17 编辑:Admin 浏览:
一个混合蛋白质样品经过腾博游戏在线凝胶电泳以后,各组分由于电泳迁移率不同而被分离。这种差异就蛋白质分子本身而言主要与分子量以及所带净电荷和形状有关。当电泳体系中含有一定浓度的SDS时,电泳迁移率的大小仅取决于蛋白质的分子量(其它影响因素可忽略不计),从而可直接由电泳迁移率推算出蛋白质的分子量。   SDS(十二烷基硫酸钠)是一种阴离子去污剂,能够与蛋白质结合,破坏蛋白质分子内部、分子之间以及与其它物质分子之间的非共价键, 使蛋白物变性而改变原有的空间构象。当有强还原剂(如巯基乙醇)存在使蛋白质分子内的二硫键被彻底还原,并且SDS 的总量为蛋白质量的3~10 倍、SDS 单位浓度大于1mol/L 时。这两者的结合是定量的,大约每克蛋白质可结合1.4克SDS。蛋白质分子一经结合了一定量的SDS阴离子,所带负电荷的量远远超过了它原有电荷量。从而消除了不同种类蛋白质间电荷的差异,且由于分子量越大的蛋白质结合的SDS越多、带负电荷也越多,这就使各蛋白质-SDS复合物的电荷密度趋于一致;同时,不同蛋白质的SDS 复合物形状也相似,均是长椭圆状。因此,在电泳过程中,迁移率就取决于蛋白质-SDS 复合物的大小,也可以说是取决于蛋白质分子量的大小。   据经验得知,当蛋白质的分子量在17 000-165 000之间时。蛋白质-SDS复合物的电泳迁移率与蛋白质分子量的对数呈线性关系:   lgMW=lgK-bm   式中MW 为蛋白质的分子量,m 为相对迁移率,K 为常数,b 为斜率。将已知分子量的标准蛋白质在SDS -腾博游戏在线凝胶中的电泳迁移率对分子量的对数作图,即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率,就能根据标准曲线求得其分子量。   【器材】   1.电泳仪   2.垂直板电泳槽   3.微量进样器   4.乳头吸管   5.50ml小烧杯   【试剂】   1.贮备液的配制   (1)30%丙烯酰胺溶液:丙烯酰胺29.2g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加水至100ml,棕色瓶4℃保存。   (2)1.5mmol/LTris-Cl分离胶缓冲液,pH8.8(4×):称取18.15g Tris,用1NHCl调pH至8.8,加水至100ml,4℃保存。   (3)1.0mmol/L Tris-Cl浓缩胶缓冲液,pH6.8(4×):称取5.98g Tris,用1NHCl调pH至6.8,加水至100ml,4℃保存。   (4)电极缓冲液(pH8.3):取14.40g甘氨酸,3.00g Tris,加10ml 10%SDS,加水至1L,4℃保存。   (5)10% SDS:取10g SDS,加水至100ml ,完全溶解后室温保存。   (6)10%过硫酸铵溶液(AP):临用前现配,或配好后-20℃分装冻存。   (7)染色液(0.25%考马斯亮蓝R-250、50%甲醇、7%乙酸):考马斯亮蓝R-250 2.5g,甲醇500ml、70ml 冰乙酸,加水至总体积1000ml(甲醇可用无水乙醇代替)。   (8)脱色液(30%甲醇、7%乙酸):甲醇300ml,冰乙酸70ml,加水至1000ml(也可用无水乙醇代替甲醇)。   (9)样品缓冲液(2×):H2O 2.4ml,浓缩胶缓冲液1.0ml、甘油0.8ml、10% SDS   3.2ml,2-硫基乙醇0.4ml。0.025%(W/V)溴酚兰0.2ml。   (10)TEMED   2.工作液的配制
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